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stata valutata così come i livelli sierici di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), fattore di crescita nervoso (NGF), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), dopamina tissutale e marcatori ossidativi.Sono state valutate l'espressione genica del recettore-Gamma attivato dal proliferatore del perossisoma (PPAR-ɣ), del fattore nucleare-kappaB (NF-kB) e dell'interleuchina-6 (IL-6).Inoltre, sono state eseguite indagini istologiche e immunoistochimiche.I risultati hanno rivelato che il toluene ha causato danno cerebrale, come evidenziato da un aumento significativo di GFAP, TNF-α, malondialdeide (MDA) e ossido nitrico (NO) sierici, una diminuzione significativa di NGF sierico, dopamina tissutale e marcatori ossidativi, inoltre, un non -cambiamento significativo del VEGF.Il toluene ha anche causato cambiamenti nella normale struttura cerebrale e degenerazione cellulare, inclusa una significativa diminuzione del numero totale di neuroni e dello spessore della corteccia frontale.Meningi che mostrano segni di infiammazione con infiltrazione ed essudazione delle cellule infiammatorie, una significativa diminuzione dell'immunoreattività MBP e aumento della percentuale di cellule positive alla proteina-1 del gruppo ad alta motilità (HMGB1).L'espressione dei geni PPAR-ɣ, NF-kB e IL-6 era tutti notevolmente elevati dal toluene.Questi cambiamenti sono stati notevolmente migliorati dal latte materno MSc.Pertanto, concludiamo che il latte materno MSc può attenuare l'encefalopatia indotta da toluene.Il toluene (C6H5CH3), noto anche come metilbenzene, fenilmetano e toluolo, era un noto idrocarburo aromatico limpido e incolore con un odore dolce e pungente1.Il toluene era un composto organico volatile ampiamente utilizzato e prodotto in enormi quantità per l'uso in un'ampia gamma di applicazioni industriali e commerciali tra cui pitture, inchiostri, adesivi, vernici, plastica, diluenti, pelle e coloranti2.Il toluene ha un'attività lipofila molto elevata.È stato assorbito per inalazione, ingestione e, in misura minore, per assorbimento cutaneo.È stato prontamente fornito a organi altamente perfusi, inclusi cervello e fegato, dove si accumula nei tessuti ricchi di lipidi1.Il fegato era l'organo chiave responsabile del metabolismo del toluene, mentre il rene era l'organo principale responsabile dell'escrezione3.L'uso improprio di solventi contenenti toluene o il contatto lavorativo provocano entrambi un'esposizione ad alta concentrazione di toluene, tuttavia coloro che abusano di solventi sono stati spesso esposti a livelli maggiori rispetto alle esposizioni professionali4.Inoltre, l'uso di comuni articoli per la casa (smalto per unghie, vernici, diluenti per vernici, adesivi, odori sintetici) e il fumo di sigaretta creano le quantità più elevate di toluene nell'aria interna5.L'avvelenamento da toluene era frequente a seguito di esposizioni ambientali, non intenzionali o intenzionali6.Il toluene era tossico per diversi organi, inclusi fegato, reni, polmoni e cuore7.Tuttavia, sia nell'uomo che negli animali, il sistema nervoso centrale (SNC) era l'obiettivo principale della tossicità acuta e cronica del toluene8.L'esposizione cronica al toluene danneggia il SNC, causando leucoencefalopatia indotta da toluene, una condizione medica comune in tutto il mondo9.Altri segni clinici, come il morbo di Parkinson, l'atassia, le malattie psichiatriche, i tremori e l'epilessia del lobo temporale, possono differire in base alle regioni cerebrali danneggiate10.Sfortunatamente, il danno neuronale indotto dal toluene sembra essere permanente e ora non era disponibile alcun trattamento diverso dall'astinenza o da farmaci neurotrofici aspecifici9.Nel cervello adulto, un numero esiguo di cellule staminali era localizzato in aree definite, ma questo vero pool di cellule staminali era modesto e non gioca un ruolo significativo nella riparazione dei tessuti11.Il trapianto di cellule staminali è stato recentemente riconosciuto come un metodo sempre più interessante per lo sviluppo di terapie per la riparazione del sistema nervoso danneggiato12.Nei modelli animali di danno cerebrale acuto, negli ultimi anni si sono accumulati dati importanti che rivelano la capacità di diversi tipi di cellule staminali di provocare la rigenerazione, ad esempio a seguito di lesioni cerebrali traumatiche acute o insulti neurovascolari13, malattie degenerative primarie del SNC come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, il morbo di Huntington14 .La terapia con cellule staminali mesenchimali ha mostrato effetti neuroprotettivi contro il danno cerebrale ipossico indotto dalla tossina come quello causato dal nitrito di sodio15.A nostra conoscenza, non sono stati condotti studi precedenti per testare il ruolo della terapia cellulare mesenchimale nel trattamento dell'encefalopatia indotta da toluene.Nel presente lavoro verrà testata l'ipotesi della capacità delle cellule staminali mesenchimali di trattare l'encefalopatia indotta da toluene.Toluene [C6H5CH3]: sostanza liquida anidra incolore con un odore aromatico pungente, peso molecolare 92,13 g/mol, purezza del 95%, numero CAS era 108-88-3, è stata acquistata dalla società El-Gomhouria per il settore farmaceutico, Egitto.1 g.il fluido di toluene è stato sciolto in 100 g.olio d'oliva per preparare una soluzione all'1% di Tol, l'1% di Tol era la dose più comune a cui i lavoratori dell'industria erano esposti16.Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): 4,5 g/L di glucosio, con L-glutammina (Cat n. 12-604Q) è stato acquistato da Lonza Bioproducts Walkersville, MD 21.793–0127 USA.Miscela di penicillina-streptomicina-amfotericina B: 10.000 unità/ml di penicillina di potassio, 10.000 µg/ml di streptomicina solfato e 25 µg/ml di amfotericina B cat n.17-745E usato come 10 ml/L da Lonza Bioproducts Walkersville, MD 21793-0127 USA.Soluzione di tripsina/EDTA: tripsina 0,25% contenente EDTA 0,02% cat n.CC-5012 di Lonza Bioproducts Walkersville, MD 21793-0127, USA.I campioni di latte sono stati raccolti dal dipartimento di pediatria degli ospedali universitari di Zagazig in conformità con le linee guida e le normative pertinenti.Tutte le procedure sperimentali sono state approvate e formate in conformità con le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Facoltà di Medicina, Università di Zagazig, Egitto.Un consenso scritto informato è stato raccolto da venti madri che allattavano sane.Sono stati raccolti dieci campioni da ciascuna madre, da due a cinque giorni dopo il parto in condizioni mediche asettiche.Seguendo il metodo spiegato da Patki, Kadam17, il latte materno umano di ciascuna madre è stato centrifugato individualmente a 285 × g per 10 minuti dopo diluizione 1:2 con una soluzione di DMEM contenente la miscela di penicillina-streptomicina-amfotericina.Il lavaggio del pellet cellulare con soluzione salina sterilizzata tamponata con fosfato (PBS) è stato eseguito due volte, quindi sono stati utilizzati supporti DMEM con siero bovino fetale (FBS 10%) (Biochrom AG, Berlino, Germania) integrato con miscela di penicillina-streptomicina-amfotericina B per seminare il cellule in un piatto di trattamento di coltura tissutale di 25 cm2.I flaconi sono stati quindi incubati in un incubatore a CO2 (Heraeus, Hanau, Germania) al 95% di umidità relativa e 37°C sotto il 5% di CO2.Come primo passaggio, il mezzo è stato sostituito ogni 2 giorni per 14 giorni.La soluzione di tripsina/EDTA è stata utilizzata per tripsinizzare le cellule a 37 ° C e confluenza dell'80% per 5 minuti, quindi è stata eseguita la centrifugazione a 2400 × g per 20 minuti, quindi le cellule sono state fatte passare al 3° passaggio per l'uso nella ricerca mediante raccolta con soluzione di tripsina/EDTA e lavaggio due volte con PBS, quindi contato mediante emocitometro.L'esclusione del trypan blue è stata utilizzata per determinare la vitalità cellulare, con le cellule vive non colorate mentre le cellule morte appaiono blu scuro.Secondo Patki, Kadam17, la capacità del latte materno in coltura MSc di attaccarsi alla base del contenitore della coltura con forma fibroblastica / fuso è stata osservata dal microscopio a immagine invertita (Fig. 1A, B).Sono state presentate l'adesività e la forma fusiforme di MSc al giorno 14 (A,B).I diagrammi di citometria a flusso (M1; negativo, M2; positivo) hanno mostrato MSc express CD105 (C), CD106 (D), CD63 (E) e CD9 (F) sulla superficie cellulare, tuttavia non esprimono CD11 (G) o CD38 (H ).(I) Micrografie a fluorescenza rappresentative della corteccia cerebrale dal gruppo trattato con toluene e latte materno dopo il dosaggio di MSc che mostrano l'homing di MSc dal colorante PKH26.Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per l'immunofenotipizzazione dei marcatori di superficie MSc;0,05% di tripsina 0,02% EDTA in PBS è stato utilizzato per staccare le cellule dal 3° passaggio seguito da sospensione in DMEM e fissazione in etanolo freddo al 70%.Le cellule sono state quindi mantenute in ghiaccio con anticorpi antiumani di topo contro CD105, CD106, CD63 e CD9 (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) coniugati con isotiocianato di fluoresceina (FITC)/ficoeritrina (PE) per 1 ora a una diluizione di 1:100.Il laser del citometro a flusso (Becton Dickinson, New Jersey, NJ, USA) 488 nm con 10.000 cellule gated è stato utilizzato per identificare le cellule.I dati sono stati quindi analizzati con il software BD Cellquest pro, che includeva porte sparse anteriori e laterali.Il MSc separato mostra CD105, CD106, CD63 e CD9 sulla superficie cellulare ma non CD11 o CD38 (Fig. 1 CH).Prima dell'iniezione, il kit di collegamento cellulare fluorescente PKH26 (Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per etichettare MSc per l'identificazione dell'homing MSc nel tessuto cerebrale.Il disegno dell'esperimento è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Zagazig in Egitto (ZU-IACUC/3/F/110/2021) e condotto in conformità con le linee guida ARRIVE.In questo studio sono stati utilizzati sessanta ratti albini maschi adulti (12 ± 1 settimana) (220 ± 20 g).I topi sono stati ottenuti dalla stalla, Facoltà di Medicina, Università di Zagazig.I ratti sono stati tenuti in gabbie separate (2 ratti per gabbia) e nutriti con normale cibo per topi in condizioni normali di laboratorio e ambiente.Gli animali sono stati trattati secondo le linee guida fornite nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Istituto nazionale di salute.Ciascun ratto è stato quindi assegnato in modo casuale in uno dei tre gruppi (gruppo di controllo, gruppo Tol e gruppo Tol/MSc; 20 ratti ciascuno): il gruppo di controllo è stato suddiviso nel sottogruppo del veicolo è stato esposto per via cutanea all'olio d'oliva solo con lo stesso metodo descritto in Tol gruppo e sottogruppo MSc che hanno ricevuto una singola dose di latte materno-MSc (5*106) per ogni ratto;iniettato attraverso la vena della coda, dopo 14 giorni dall'inizio della somministrazione, gruppo trattato con toluene (gruppo Tol): un'area di circa 10 cm2 sul dorso di ciascun ratto è stata tosata 24 h.prima della somministrazione cutanea di toluene per evitare lesioni cutanee e lavato con acetone, quindi un anello di silicone (spessore × diametro; 2 mm × 34 mm) è stato incollato sulla pelle18 e un batuffolo di cotone imbevuto in una soluzione precedentemente preparata di 1% Tol in olio d'oliva è stato applicato all'interno dell'anello 5 ore al giorno per 14 giorni19.Una garza a rete di nylon è stata quindi incollata sulla superficie dell'anello di silicone ed è stata utilizzata una benda porosa per avvolgere il tronco dell'animale.Dopo 5 h.di esposizione, la benda e la garza rimosse e la pelle lavata con acqua e sapone, gruppo trattato con toluene/MSc (gruppo Tol/MSc): ha ricevuto toluene nello stesso regime del gruppo Tol e dopo la fine della somministrazione di toluene i ratti hanno ricevuto una singola dose di latte materno-MSc (5 × 106) da singolo donatore per ogni ratto;iniettato attraverso la vena della coda.Prima del trapianto, le cellule sono state risospese in 0,5 ml di DMEM (4,5 g/l di glucosio con L-glutammina, Lonza Bioproducts Walkersville, MD 21.793–0127 USA).Lo stesso volume di DMEM è stato iniettato nella vena della coda dei ratti trattati con olio d'oliva e trattati con Tol.Tre settimane dopo il trapianto di cellule staminali mesenchimali, i ratti sono stati pesati, osservati per segni di tossicità generale e locale e sono stati sottoposti a valutazione neurologica.Seguendo il metodo spiegato da Zin'kova, Gilerovich20, sono stati utilizzati sei test per misurare la funzione neurologica;ciascuno è stato valutato tra 0 e 3 e ogni ratto è stato valutato su una scala di 18 punti.Questi test includono l'attività spontanea, l'uso simmetrico della zampa durante la mobilità, l'uso simmetrico delle zampe anteriori mentre erano l'unico supporto dell'animale, l'uso simmetrico della zampa per afferrare una superficie della rete, la reazione all'irritazione della propriocezione del corpo e la reazione al contatto con la vibrissa.Tre settimane dopo l'iniezione di cellule staminali, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di tiopentale (50 mg/kg) e un campione di sangue dal plesso retroorbitale di ciascun ratto è stato raccolto mediante tubi capillari di vetro seguendo il metodo spiegato da van Herck, Baumans21, I campioni sono stati lasciati coagulare spontaneamente, quindi centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti per separare i sieri che sono stati poi conservati a -20 °C per la successiva analisi di:Proteina acida fibrillare gliale (GFAP): per la valutazione è stato utilizzato il kit GFAP ELISA con gatto n. NS830 (Millipore, Temecula, CA) acquistato da Sigma-Aldrich.Questo kit utilizza un principio Sandwich-ELISA ad alta sensibilità.Alla lunghezza d'onda di 450 nm, la densità ottica (OD) è stata stimata spettrofotometricamente.I valori di OD erano proporzionali alla concentrazione di GFAP nel ratto (ng/ml).Fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-alfa): per la sua stima è stato utilizzato il kit ELISA TNF-alfa di ratto di MyBiosource (San Diego, California, Stati Uniti) con n. gatto (MBS2507393).Il principio Sandwich-ELISA è stato utilizzato in questo kit ELISA.Ad una lunghezza d'onda di 450 nm 2 nm, la DO è stata misurata spettrofotometricamente dove i valori erano correlati alla concentrazione di TNF nel ratto.Fattore di crescita nervosa (NGF): è stato stimato utilizzando un kit ELISA di MyBiosource (San Diego, California, Stati Uniti) con cat no (MBS355321) secondo le istruzioni del produttore.La quantità di NGF nel campione (pg/ml) era proporzionata all'intensità del colore sviluppato che era stimata a 450 nm.Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF): i livelli sierici di VEGF in pg/ml sono stati stimati tramite VEGF ratto ELISA Kit di MyBiosource (San Diego, California, Stati Uniti) con n. gatto (MBS724516) secondo le istruzioni del produttore.Il kit utilizza il metodo competitivo immunoenzimatico utilizzando un anticorpo anti-VEGF e un coniugato VEGF-HRP.Dopo aver ottenuto campioni di sangue, i ratti sono stati sacrificati;il cervello di ciascun animale è stato accuratamente sezionato e pesato, una metà degli emisferi cerebrali è stata lavata con soluzione fisiologica ghiacciata in cui una porzione è stata omogeneizzata utilizzando PBS 0,1 M a pH 7,4 per ottenere una concentrazione del 10% p/v per l'analisi biochimica ( livelli di dopamina cerebrale e parametri di stress ossidativo).Un'altra porzione è stata omogeneizzata e conservata a -80 ° C per la successiva analisi PCR in tempo reale dei marcatori di superficie della MSc umana e l'analisi dell'espressione genica di Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPAR-ɣ), Nuclear factor-kappa B (NF-kB) e Interleuchina-6 (IL-6).L'altro emisfero cerebrale è stato immerso immediatamente in formalina tamponata al 10% per 48 ore da maneggiare per la preparazione di sezioni di paraffina spesse 5 μm per l'esame al microscopio a fluorescenza, H&E e colorazione immunoistochimica.Il livello di dopamina cerebrale è stato stimato utilizzando Rat dopamine, DA ELISA Kit di Cusabio Co., Wuhan, Cina con cat no (CSB-E08660r) seguendo le istruzioni del produttore.Il kit che utilizza la tecnica quantitativa di immunodosaggio enzimatico sandwich.L'intensità del colore generato a 450 nm era correlata alla quantità di dopamina nel campione (proteina ng/mg).Parametri dello stress ossidativo cerebrale: prodotti di perossidazione lipidica malondialdeide (MDA): è stato stimato utilizzando un kit di biodiagnostica (Giza, Egitto con un cat. n. MD 2529) secondo le istruzioni del kit22.Ossido nitrico: il livello di NO è stato determinato da un kit biodiagnostico in cui il vanadiotricloruro è stato aggiunto ai supernatanti per ridurre i nitrati in nitriti seguendo Miranda, Espey23.Attività della glutatione perossidasi: l'attività è stata misurata nel tessuto cerebrale (proteina U/g) utilizzando il kit biodiagnostico seguendo Paglia e Valentine24.Attività della catalasi (proteina U/g): è stata stimata seguendo il metodo di Aebi25.L'attività della superossido dismutasi (SOD) è stata misurata (proteina U/g) dopo Nishikimi, Appaji Rao26 utilizzando il kit biodiagnostico.Il tessuto cerebrale è stato esaminato al microscopio a fluorescenza per i gruppi trattati con MSc.Inoltre, determinazione dei marcatori di superficie di MSc umana mediante PCR in tempo reale per i seguenti geni: Human GAPDH “forward, 5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3, reverse, 5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3”, Human CD105 “forward, 5′-TCCTCCCAAGGACACTTGTA- 3, retromarcia, 5′-CGCCTCATTGCTGATCATAC-3” e Human CD34 “avanti, 5′-GGAAGGATGCTGGTCCG-3, retromarcia, 5′-CTGGGGTAGCAGTACCGTTG-3”.L'RNA totale è stato estratto dall'omogenato di tessuto cerebrale mediante il kit di estrazione miRNeasy (QIAGEN; Valencia, CA) seguendo le raccomandazioni del produttore.Lo spettrofotometro NanoDrop è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA estratto stimando la DO a 260 e 280 nm e accettando A260/A280 con un rapporto di 1,8–2,1.Per la trascrizione inversa e la sintesi di cDNA, è stato impiegato il kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità Applied BiosystemsTM di Thermo Fisher Scientific.I livelli di espressione di PPAR-ɣ, NF-kB e IL-6 sono stati valutati mediante qRT-PCR utilizzando il sistema Mx3005P Real-Time PCR (Agilent Stratagene, USA) consumando i primer nella tabella supplementare S1 e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH ) come gene domestico.La miscela PCR utilizzata era 20 mL che contengono 10 µl di TOPreal™ qPCR 2X PreMIX (SYBR Green con basso ROX), 1 µl di ciascun primer (10 pmol/µl), 1 µl di DNA templato.I parametri del ciclo erano denaturazione primaria a 95 ° C per 12 minuti, quindi 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 20 s, ricottura a 60 ° C per 30 s ed estensione a 72 ° C per 30 s.I risultati ottenuti sono stati espressi come fold-change rispetto al gruppo di controllo secondo il metodo 2−ΔΔCT27.Le sezioni di paraffina dei lobi frontali di 10 ratti/gruppo sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E) per dimostrare la struttura istologica secondo Bancroft e Layton28, 10 campi di 3 sezioni di ciascun ratto sono stati codificati consentendo un esame e una valutazione alla cieca.Le immagini di valutazione sono state studiate utilizzando il software imageJ (ImageJ/Fiji 1.46r, https://imagej.nih.gov/ij/index.html).utilizzando 5 diverse sezioni orizzontali non sovrapposte di ciascun animale e sono stati misurati i seguenti parametri: (1) lo spessore della corteccia frontale;da ciascuna sezione sono state quantificate 20 linee perpendicolari tra il bianco e la pia madre a 100 × ingrandimento29.(2) Numero totale di neuroni (piramidali o granulari) per campo;a 400 × ingrandimento30.Per lo studio immunoistochimico, i lobi frontali del cervello degli altri 10 ratti/gruppo sono stati fissati durante la notte utilizzando paraformaldeide al 4% in PBS, disidratati e incorporati in paraffina.La marcatura immunocitochimica è stata eseguita da anticorpi monoclonali anti-MBP e anticorpi anti-HMGB1 (Millipore Corporation Billerica, USA) su sezioni cerebrali spesse 5 μm.Le sezioni deparaffinate sono state pre-incubate con tampone citrato e risciacquate tre volte con 0,01 mol/L di PBS.Per il trattamento della Sezione è stato utilizzato perossido di idrogeno allo 0,3%.Successivamente, le sezioni sono state incubate per 1 ora a 37 ° C con BSA al 3% per inibire il legame non specifico e quindi incubate con anticorpi Anti-MBP (Millipore MAB382) e Anti-HMGB1 (Millipore MAB382) con concentrazione 1:100.Dopo il risciacquo con PBS, il tessuto sezionato è stato trattato per 10 minuti con l'anticorpo secondario biotinilato.Dopo tre risciacqui con PBS, la sezione è stata lavata con Streptavidina HRP.L'immunoreattività è stata visualizzata utilizzando DAB per 30 minuti.Di conseguenza, i vetrini sono stati colorati di contrasto con l'ematossilina di Mayer e dotati di un vetrino coprioggetto.Le microfotografie sono state scattate con un microscopio ottico (a × 400 ingrandimenti), 10 campi da 3 sezioni di ciascun ratto sono stati codificati per essere esaminati e valutati alla cieca.il software imageJ (ImageJ/Fiji 1.46r, https://imagej.nih.gov/ij/index.html) è stato utilizzato per il calcolo della percentuale di immunoreattività MBP;Sono state esaminate 5 diverse sezioni non sovrapposte di ciascun animale31.Le cellule HMGB1-positive sono state definite come cellule disorganizzate con citoplasma macchiato di marrone scuro.In ciascuna sezione, le cellule positive sono state identificate, numerate ed esaminate e sono state valutate utilizzando il software imageJ.L'immunoreattività di HMGB1 è stata utilizzata per calcolare la percentuale di cellule HMGB1 positive in ciascuna sezione;Sono state esaminate 5 diverse sezioni non sovrapposte di ciascun animale32.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Zagazig in Egitto (ZU-IACUC/3/F/110/2021).Non è stata osservata alcuna differenza tra il sottogruppo di controllo trattato con veicolo e i sottogruppi MSc per quanto riguarda tutti i parametri delle misure.Nei gruppi trattati con Tol sono stati osservati segni minimi di irritazione cutanea sotto forma di arrossamento.Tuttavia, in nessuno dei gruppi sono stati rilevati altri segni di tossicità clinica, decessi o alterazioni del peso corporeo.Tuttavia, è stato notato un aumento significativo del peso cerebrale nel gruppo Tol rispetto ai gruppi di controllo e Tol/MSc (Fig. 2).I risultati dei punteggi totali dei 6 test neurologici hanno mostrato una diminuzione significativa nel gruppo Tol rispetto al gruppo di controllo, tuttavia, lo stato neurologico è tornato al livello degli animali di controllo nel gruppo Tol/MSc (Fig. 2).Grafici (A) peso corporeo del ratto, (B) peso cerebrale del ratto, (C) peso relativo del cervello "% peso cerebrale/peso corporeo" (C) punteggi totali dei 6 test neurologici in diversi gruppi studiati.*differenza significativa, **differenza altamente significativa.Al microscopio fluorescente, MSc contrassegnato da PKH26 è apparso come punti luminosi nel tessuto cerebrale del gruppo trattato con Tol e MSc (Fig. 1I).inoltre, l'espressione genica della PCR ha rivelato espressione positiva di marcatori non ematopoietici (CD105 umano) (1,09 ± 0,15) ed espressione negativa di marcatori ematopoietici (CD34 umano) nei gruppi trattati con MSc.Questi risultati hanno indicato il successo dell'homing di MSc nel tessuto cerebrale.I risultati dell'attuale studio hanno rivelato che il gruppo Tol aveva un livello significativamente maggiore di GFAP rispetto al gruppo di controllo (p = 0,001), mentre i livelli del gruppo Tol/MSc erano significativamente inferiori rispetto al toluene (p = 0,001) ma significativamente superiori ai ratti di controllo (p = 0,001) (Tabella 1).La tabella 1 ha anche mostrato che la somministrazione di toluene ha causato un aumento significativo del TNF-α rispetto ai ratti di controllo (p = 0,001) e le concentrazioni si sono attenuate significativamente dalla somministrazione concomitante di latte materno-MSc rispetto al trattamento con toluene (p = 0,001) con non -significato dal controllo (p = 0,53).Come mostrato nella Tabella 1, il presente studio ha rivelato una significativa diminuzione del livello di NGF nel gruppo trattato con toluene rispetto ai ratti di controllo (p <0,01) e le concentrazioni sono aumentate significativamente nel gruppo trattato con Tol-MSc (p <0,01) con non- variazione significativa dal controllo (p = 0,264).La tabella 1 ha rivelato una differenza non significativa nei livelli sierici di VEGF tra il gruppo di controllo e il gruppo trattato con Tol (p = 0,87), mentre i livelli erano significativamente maggiori nel gruppo Tol-MSc rispetto al gruppo di controllo (p = 0,001) e al gruppo trattato con Tol ( p = 0,001).Il livello di dopamina cerebrale nella Tabella 1 ha mostrato una diminuzione significativa nei ratti esposti al toluene rispetto ai ratti di controllo (p = 0,001), mentre il livello nel toluene e nel latte materno MSc era significativamente più alto nei ratti trattati con Tol (p = 0,008). ) e significativamente inferiore rispetto ai ratti di controllo (p = 0,001).Per quanto riguarda i parametri di stress ossidato, il livello di MDA è stato significativamente maggiore nei ratti Tol-esposti rispetto ai ratti di controllo (p = 0,001), mentre i livelli sono diminuiti significativamente con il trattamento Tol-MSc rispetto al gruppo Tol (p = 0,001) e significativamente maggiore del controllo (p = 0,005).C'era un aumento significativo di NO nel gruppo Tol in relazione ai livelli di controllo (p = 0,001), mentre i valori nel gruppo Tol/MSc sono diminuiti significativamente rispetto al gruppo Tol (p = 0,001) e non significativamente differenti dal controllo (p = 0,054) (Tabella 1).Come mostrato in (Tabella 1), i livelli dell'enzima antiossidante SOD, CAT, GPx sono diminuiti significativamente nel gruppo Tol rispetto al gruppo di controllo (p = 0,001) e il livello è aumentato significativamente con toluene combinato e latte materno MSc trattamento (p = 0,001) ma comunque inferiore ai valori di controllo (p = 0,001).La tabella 2 ha mostrato che il trattamento con toluene nel gruppo Tol ha indotto una significativa riduzione dell'espressione genica PPAR-ɣ in relazione al gruppo di controllo (p = 0,001).Il co-trattamento con latte materno-MSc nel gruppo Tol/MSc ha comportato un aumento significativo dell'espressione genica PPAR-ɣ in relazione al gruppo Tol (p = 0,001) con un cambiamento non significativo dal controllo (p = 0,775) e c'era una forte correlazione positiva tra l'espressione genica PPAR-ɣ e i livelli di VEGF (r = 0,8285 e p = 0,001).Confrontando il gruppo Tol con il gruppo di controllo, c'era un aumento significativo nell'espressione genica di NF-kB (p = 0,001).I livelli si sono ridotti nel toluene e nel latte materno MSc rispetto al gruppo Tol (p = 0,001) e non differivano significativamente dal gruppo di controllo.(p = 0,692).C'era una forte correlazione positiva tra i livelli sierici di TNF-α e l'espressione del gene NF-kB (r = 0,853, p = 0,001).Confrontando il gruppo Tol con il gruppo di controllo, si è verificato un aumento sostanziale dell'espressione genica di IL-6 (p = 0,001).I valori nel gruppo Tol/MSc erano inferiori rispetto al gruppo toluene (p = 0,001), ma ancora significativamente al di sopra del gruppo di controllo (p = 0,001).I tessuti cerebrali colorati con ematossilina ed eosina dai sottogruppi di controllo mostravano un pattern istologico normale per quanto riguarda la corteccia cerebrale e la sostanza bianca, la corteccia era composta da sei strati cellulari;strato molecolare, strato granulare esterno, strato piramidale esterno, strato granulare interno, strato piramidale interno e strato multiforme, inoltre, la sostanza bianca mostrava una normale struttura omogenea senza vacuoli (Fig. 3A).Gli strati corticali erano costituiti da diverse popolazioni di cellule con piccole cellule gliali scure sparse su uno sfondo rosa omogeneo di neuropili.Le cellule piramidali caratterizzate da citoplasma basofilo e dendriti apicali (Fig. 3B), le cellule granulari erano caratterizzate da nuclei vescicolari e nucleoli prominenti (Fig. 3C).Al contrario, sebbene a 3 settimane dall'ultima dose di toluene, il gruppo Tol ha rivelato una variazione della caratteristica composizione corticale che si manifestava come degenerazione cellulare delle cellule corticali (nuclei picnotici ipercromatici all'interno del citoplasma vacuolato), inoltre, la sostanza bianca e il fondo del neuropilo hanno perso la loro normale omogeneità con il comparsa di vacuoli e alterazioni idropiche, meningi che mostravano segni di infiammazione con infiltrazione ed essudazione di cellule infiammatorie, vasi sanguigni corticali congestionati, dilatati con stravaso ed emorragia (Fig. 3D-I).Nel gruppo Tol/MSc, i tessuti corticali cerebrali hanno mantenuto le loro proporzioni e architetture normali.C'erano diversi neuroni con nuclei vescicolari e nucleoli prominenti e alcuni neuroni con nuclei macchiati di scuro.Inoltre, la sostanza bianca e lo sfondo omogeneo del neuropilo erano con meno vacuolazioni e meno cambiamenti idropici.Le meningi erano normalmente attaccate alla superficie cerebrale (Fig. 3J-L).tratto da ratto trattato con toluene che mostra (D,G 100 × H&E, E,F,H,I 400 × H&E);meningi che mostrano segni di infiammazione con infiltrazione ed essudazione di cellule infiammatorie (frecce a zigzag) con vasi sanguigni corticali (BV) congestionati e dilatati con stravaso ed emorragia (H), sfondo neuropilico ha perso la sua normale omogeneità con la comparsa di vacuoli (stelle) e alterazioni idropiche (punte di freccia), neuroni contenenti nuclei picnotici ipercromatici all'interno del citoplasma vacuolato (frecce), inoltre la sostanza bianca appariva vacuolata (doppie frecce).Micrografie prese dal gruppo trattato con toluene e latte materno MSc (J) una micrografia 100 × H&E che mostra i diversi strati della corteccia cerebrale;(K, L) 400 micrografie H&E che mostrano il recupero della costruzione istologica di base, cellule piramidali (frecce), cellule granulari (frecce spesse) con nuclei picnotici sparsi (punte di freccia), sostanza bianca e neuropilo con meno vacuoli (stelle).Le meningi mostravano un'architettura normale sulla superficie cerebrale (frecce a zigzag).(M,N) grafici che mostrano la valutazione quantitativa dello spessore corticale e totale n.di neurone/ archiviato.I dati sono stati espressi come media ± DS, *significativo rispetto al gruppo di controllo, **significativo rispetto al gruppo del toluene.H&E Fotomicrografie del tessuto cerebrale.(A) Una micrografia H&E 100 × di gruppi di controllo e MSC che presentano gli strati della corteccia cerebrale;strato molecolare esterno (MO), strato granulare esterno (EG), strato piramidale esterno (EP), strato granulare interno (IG), strato piramidale interno (IP) e strato multiforme (MF), oltre alla sostanza bianca (WM) , materia pia sottile e normalmente attaccata alla corteccia (p), (B,C) micrografie 400 × H&E che mostrano le cellule piramidali caratterizzate da citoplasma basofilo e processi apicali (frecce), le cellule granulari che mostrano nucleoli vescicolari e prominenti (frecce spesse ), le cellule della glia che mostrano piccoli nuclei densi (punte di freccia) e uno sfondo omogeneo neuropil rosa (stella).MicrofotografieAggiungendo alle lesioni patologiche delle cellule corticali, lo spessore della corteccia frontale e il numero totale di neuroni del gruppo Tol erano significativamente inferiori a quello del controllo (P <0,0001).La somministrazione di cellule staminali mesenchimali ha portato alla riparazione di questi cambiamenti istopatologici (Fig. 3 M, N, Tabella 3).La maggior parte delle fibre mieliniche colorate con immunoistochimica con anti-MBP sembravano goccioline arrotondate (tagli trasversali), anche alcune fibre mieliniche colorate con immunoistochimica sembravano linee sottili (tagli longitudinali).Il calcolo della percentuale di immunoreattività MBP ha rivelato che era significativamente più bassa nel gruppo Tol rispetto al gruppo di controllo, indicando che il toluene induceva la perdita della guaina mielinica nel tessuto cerebrale.Tuttavia, la terapia con latte materno MSc nel terzo gruppo ha mostrato un grande miglioramento dell'immunoreattività MBP con una differenza significativa rispetto sia al gruppo di controllo che a quello trattato con toluene (Fig. 4A-D, I, Tabella 3).Colorazione immunoistochimica per anti-MBP, anti-HMGB1;Ingrandimento 400 ×.Le fibre mieliniche colorate con anti-MBP (gruppo di controllo A; gruppo trattato con toluene B, C; gruppo trattato con MSc con toluene e latte materno) appaiono come goccioline arrotondate se mostrano tagli trasversali (punte di freccia) e linee sottili se mostrano tagli longitudinali (frecce) b: diminuzione della densità della mielina.(I) grafici che mostrano l'analisi quantitativa della percentuale di immunoreattività MBP.Anti-HMGB1 (gruppo di controllo E; gruppo trattato con toluene F, G; gruppo H: toluene e latte materno trattato con MSc) I corpi cellulari normali colorati con anti-HMGB1 appaiono intatti con un nucleo marrone scuro e un debole citoplasma (teste di freccia).Le cellule HMGB1-positive apparivano disordinate con citoplasma colorato di marrone scuro (frecce).(J) grafici che mostrano l'analisi quantitativa della percentuale di cellule positive HMGB1 in ciascun gruppo.I dati sono stati rappresentati come media ± DS, *significativo rispetto al gruppo di controllo, **significativo rispetto al gruppo del toluene.esp.Sci.Lett.Lett.Cellula.int.Cellula.Scienziato della vitaSci.Sci.Sci.esp.Nat.esp.Nat.Proc.